Exportaciones de carne para Estados Unidos y Europa dependen de la ausencia del grupo de bacterias E.coli shigatoxigenicas, las E.coli STEC.

Históricamente E.coli O157:H7 es uno de los patógenos más buscado en las muestras cárnicas. Desde 2011 con la publicación del Federal Register Vol.76 del 20 septiembre, fue obligatorio adicionar un control de otras E.coli shigatoxigénicas, obligando un nuevo control de 6 serotipos adicionales de E.coli que son: E.coli O26, O45, O103, O111. O121 y la O145. Este grupo pasó a ser llamado de E.coli Top7STEC a E.coli Big7STEC. Igualmente, Europa hace obligatorio el control de E.coli pero adoptando una exigencia diferente que es la ausencia de cualquier E.coli productora de Shigatoxina  STX1 o STX2 sin importar si está presente el gen “eae” el cual es el encargado que E.coli se adhiera a la pared intestinal para transferir la toxina. Muchas E.coli producen shigatoxina pero no se adhieren a la pared intestinal y por esta razón no causan intoxicación; como en Europa ocurrieron brotes causados por otras E.coli que no pertenecen al grupo Top7 mencionadas anteriormente se culminó en 2018 la publicación de la guía de la FAO ISSN1726-5274.

Características Genéticas y métodos analíticos

El análisis de las E.coli STEC permite el uso de métodos de inmunoensayos (antígeno – anticuerpo) para el caso de la exportación para Europa donde se busca ausencia de E.coli que presenten STX1 o STX2. Un ejemplo de esta aplicación es el método de flujo lateral DuoPath®.

fragment1

El DuoPath® es un método screening que permite liberar lotes de carnes cuando las líneas SLT1 o SLT2 no aparecen indicando ausencia de E.coli productora de shigatoxina.

Para conseguir la identificación del serogrupo de E.coli es necesario el uso de la detección genética en este análisis, por esta razón el método que se emplea es la PCR (Reacción de Polimerasa en Cadena).

Existen más de 10 metodologías de PCR desarrolladas para detección del grupo E.coli Top7 STEC por esta razón es importante conocer algunas características claves para utilizar el método de PCR más específico, más sensible, más reproducible y suficientemente simple para ser aplicado en rutina en el laboratorio de microbiología. Una característica importante para detectar o identificar este patógeno es el uso de una técnica llamada Inmuno-Separación Magnética (ISM) que es la captura de las bacterias usando partículas magnéticas. Por esta razón es importante utilizar una metodológica que integre la ISM en el protocolo.

Puntos a considerar para usar un método de PCR para detectar e identificar E.coli Top7

  1. El método debe ser validado por institutos internacionales como AOAC o Microval por esta razón el Kit con los reactivos deben ser específicos para el termociclador utilizado. Adaptar kits a cualquier termociclador no trae las validaciones internacionales.
  2. El volumen para el pipeteo del caldo después del enriquecimiento con la muestra tiene que ser el mayor posible para eliminar posibilidad de falsos negativo por perder la bacteria durante el pipeteo.
  3. Tener control interno en cada uno de los tubos de amplificación garantizando que los negativos son realmente negativos.
  4. Buscar la posibilidad de eliminar la extracción del ADN en el laboratorio para eliminar la posibilidad de contaminar el laboratorio con ADN del patógeno.
  5. Termociclador Rotativo con calentamiento por aire es más eficiente que bloques sólidos tipo Peltier.
  6. PCR Multiplex permite detectar varios genes en el mismo tubo de amplificación.
  7. El sistema tiene que estar disponible en el país incluso de asistencia técnica de equipos e inventario de kits.
  8. El costo debe ser compatible con la importancia de la detección. La decisión para este tipo de análisis debe ser hecha primero por la gerencia del laboratorio.

El Método PCR Assurance GDS®

El método GDS® tiene características que atienden las actuales exigencias analíticas para detección de patógenos en alimentos. GDS® consiste en 2 métodos combinados: PCR tiempo – real con la InmunoSeparación magnética de Inmersión.

Paso 1- Capturando las E.coli Top7STEC.

Para la detección de las E.coli Top7STEC se agrega partículas magnéticas cargadas con anticuerpos contra las Top7STEC deseadas. Usando la Pickpen® se  logra la captura de las partículas magnéticas que estarán cargadas con las E.coli Top7STEC que se quieren detectar.

Pickpen frente

 

La PickPen® tiene un formato como si fuera una pipeta multi canal pero no lo es ;en la punta hay 8 imanes y cada punta es protegida para capturar las partículas magnéticas. Por usar la PickPen® los protocolos de GDS permiten pipetear 1ml del caldo de enriquecimiento con la muestra.

 

Paso 2- Amplificando y detectando las E.coli Top7STEC.

Las partículas cargadas con las bacterias que queremos detectar son transferidas a los tubos de amplificación y los respectivos tubos son colocados dentro del termociclador. El proceso de termociclage lleva solo 85 minutos.

Pickpen frente3No hay extracción de ADN fuera del termociclador eliminando riesgo de contaminación.

Paso 3- Termociclage

Durante el termociclage los tubos positivos amplifican el ADN del patógeno que estamos buscando. En cada amplificación se genera fluorescencia que es detectada por el foto – multiplicador y en señal enviada para el software.

Resultado Final GDS®

GDS Multiplex Software

En la misma corrida las E.coli Top7Stec son detectadas a través del gen “eae” y de los genes productores de las toxinas “stx1 o stx2” La E.coli O157:H7 es identificada por el canal exclusivo de detección. Los controles internos para cada tubo están en la gráfica menor en la parte más debajo de las gráficas.