Erin Crowley1, Patrick Bird1, Kiel Fisher1, M. Joseph Benzinger, Jr.1, Megan Boyle1, James Agin1, Dave Goins1, Corinna Kueppers, Marcia Armstrong2, Sarah Fakih2, 1 Q Laboratories, Inc., Cincinnati, OH, USA; 2 QIAGEN GmbH, Hilden, Germany.

La Salmonella es una bacteria que frecuentemente da origen a enfermedades causadas por los alimentos, también conocidas como “intoxicaciones alimentarias”. Cada año en los Estados Unidos la Salmonella da origen a 1 millón de casos de enfermedades causadas por los alimentos. En los últimos años, los brotes de salmonelosis han sido vinculados a la contaminación de pepinos, pollo, huevos, pistachos, atún crudo, germinados y muchos otros alimentos,  estos datos según reportes del Centro para el control de enfermedades. (CDC).

La detección y aislamiento de salmonella por métodos microbiológicos tradicionales se basa en un paso de pre-enriquecimiento generalmente realizado en agua peptonada, un paso de enriquecimiento selectivo si el alimento lo requiere en caldo RVS y MKTT y otro paso final  de aislamiento e identificación en medios selectivos como el XLD, las colonias sospechosas son sometidas a confirmación bioquímica,  con el uso de kits comerciales (paneles de identificación) o pruebas en tubo,  y morfológica/serológica.

 Sin embargo estos métodos microbiológicos son laboriosos y la obtención de resultados puede tomar de días a semanas, lo que a nivel de la industria alimentaria puede representar largos tiempos para la liberación de lotes de producción y/o liberación de áreas limpias, además la sensibilidad con estos métodos es baja y está sujeta  a muchos factores asociados al muestreo.

En contraste lo métodos moleculares, basados en la detección específica del ADN del patógeno, como la PCR en tiempo real, además de proporcionar una alta sensibilidad permiten obtener resultados de manera inmediata dependiendo del tipo de muestra, además el uso de cebadores (pequeños fragmentos de ADN) que hibridan solamente con el ADN del patógeno específico garantizan la alta especificad de estos métodos.

El propósito de esta evaluación es determinar la eficiencia del  kit molecular para detección de Salmonella de la marca Qiagen junto con métodos de extracción de ADN manual  y automatizado, en muestras de superficies, comparando los resultados con el método de referencia.

Resumen

Introducción: Los ensayos de detección de patógenos precisos y fáciles de usar tienen una gran demanda para analizar tanto alimentos como superficies ambientales.

Los protocolos de detección de QIAGEN mericon para Salmonella spp. se basan en la PCR en tiempo real. El ADN bacteriano puede serobtenido manualmente con el kit mericon DNA Bacteria o la purificación se puede automatizar con el equipo QIAsymphony®y el kit de bacterias QIAsymphonymericon. El ADN purificado se somete a la PCR en tiempo real con el kit mericonSalmonella spp. en el Rotor-Gene® Q.

Propósito: Evaluar la detección de Salmonella spp. en varias superficies utilizando el flujo de trabajo mericon como parte de una matriz de extensión del proceso de prueba de rendimiento del método.

Métodos: Analizamos 4 superficies ambientales (acero inoxidable, hormigón sellado, cerámica y plástico) inoculado con diferentes serotipos de Salmonella. Usamos 20 porciones de prueba a ~ 20 UFC / ml, 5 a ~ 200 UFC / ml,y 5 controles sin inocular. Para cada superficie, el ADN se purificó utilizando el método manual y automátizado, y analizados con el ensayo de PCR en tiempo real mericon. Los resultados se compararon con los del método de referencia ISO 6579.

Resultados: No se encontraron diferencias entre los dos procedimientos y el método de referencia utilizando la Probabilidad de Modelo estadístico de detección (POD).

Importancia: Este nuevo método es una alternativa eficiente y confiable a los métodos tradicionales microbiológicos de detección de Salmonellaspp. en las superficies ambientales seleccionadas.

Resultados de la comparación de métodos

Resultados de la comparacion de metodos

Extracción automatizada de ADN: POD Presuntiva vs Confirmada

Extraccion automatizada de ADN  POD Presuntiva vs Confirmada

Extracción automatizada de ADN: POD Candidata vs Referencia

Extraccion automatizada de ADN  POD Candidata vs Referencia

Los datos para la extracción manual son similares (no se muestran)

Soluciones de flujo de trabajo de QIAGEN para la detección de patógenos

Soluciones de flujo de trabajo de QIAGEN para la deteccion de patogenos

                                                  Detección de bacterias patógenas en alimentos.                                              o en muestras de superficie ambiental

 

Se incubaron hisopos o esponjas de superficie ambiental a 37ºC durante 18 + 2 h en agua con peptona tamponada (BPW). Después de la incubación, alícuotas de los cultivos de enriquecimiento se utilizaron para la purificación de ADN utilizando el kit mericon DNA Bacteria (flujo de trabajo manual) o el kit QIAsymphonymericon Bacteria en el instrumento QIAsymphony (flujo de trabajo automatizado). Todos los extractos de ADN se analizaron para detectar la presencia de ADN de Salmonella spp. utilizando el Kitmericon Salmonella spp.  El método ISO 6579 para la detección de Salmonella spp. se utilizó como método de referencia.

Conclusión

  • Tanto el protocolo manual como el automatizado se comparan favorablemente con el método de referencia, ISO 6579, para la detección de Salmonella spp. sobre las superficies ambientales estudiadas.
  • La opción de preparación de muestras y configuración de ensayo manual o automatizada brinda flexibilidad en términos de rendimiento sin pérdida de fiabilidad o sensibilidad.
  • Los flujos de trabajo de detección de QIAGEN mericon Salmonella spp. son alternativas viables y confiables a los métodos tradicionales basados en cultivo de Salmonella spp. detección en alimentos y en superficies ambientales.
  • El kit detección QIAGENmericon Salmonella spp., mostró concordancia  total  en la detección de Salmonella spp.
  • Estos métodos de detección molecular definitivamente pueden agilizar el flujo de trabajo en el laboratorio de control calidad y así favorecer que los procesos industriales sean más ágiles.

AOAC

Para obtener información actualizada sobre licencias y exenciones de responsabilidad específicas del producto, consulte el manual del usuario o el manual del kit de QIAGEN correspondiente.

Los manuales de usuario y los manuales de los kits de QIAGEN están disponibles en www.qiagen.com o pueden solicitarse al departamento de servicio técnico de QIAGEN o su distribuidor local.